食品安全国家标准品中叶酸的测定GB5009.211-2022.pdf

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准犌犅 食品安全国家标准食品中叶酸的测定 发布 实施中华人民共和国国家卫生健康委员会国 家 市 场 监 督 管 理 总 局发 布犌犅 前言本标准代替 食品安全国家标准食品中叶酸的测定。本标准与 相比，主要变化如下：增加了微孔板测定方法；修改了精密度要求；修改了附录。犌犅 食品安全国家标准食品中叶酸的测定范围本标准规定了食品中叶酸的测定方法。本标准适用于食品中叶酸的测定。原理叶酸是鼠李糖乳杆菌（犔犪 犮 狋 狅 犫 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊狉 犺 犪犿狀 狅 狊 狌 狊）生长所必需的营养素。在一定控制条件下，将鼠李糖乳杆菌菌液接种至含有试样液的培养基中，培养一段时间后测定透光率（或吸光度值），在一定测定范围内可以根据叶酸含量与透光率（或吸光度值）的标准曲线计算出试样中叶酸的含量。试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 规定的二级水。试剂 盐酸（）。氢氧化钠（）。氯化钠（）。十二水合磷酸钠（）。七水合磷酸氢二钠（）。抗坏血酸（）。甲苯（）。无水乙醇（）。鸡胰腺冻干粉：含 谷胺酰基水解酶。木瓜蛋白酶：酶活力。淀粉酶：酶活力。试剂配制 磷酸盐缓冲液（，）：分别称取 十二水合磷酸钠和 七水合磷酸氢二钠，加水溶解并定容至，混匀。加入甲苯，室温保存。临用前按约的比例加入 抗坏血酸作为叶酸保护剂，调节至 。乙醇溶液（）：量取 无水乙醇与 水混匀。氢氧化钠乙醇溶液（）：称取 氢氧化钠，用 乙醇溶液溶解并定容至，混匀。氢氧化钠溶液（）：称取 氢氧化钠，加水溶解并定容至，混匀。犌犅 盐酸浸泡液：量取 盐酸（浓度 ）与 倍水混合。鸡胰腺溶液：称取 鸡胰腺冻干粉，加入 磷酸盐缓冲液，摇匀。现用现配。蛋白酶淀粉酶液：分别称取 木瓜蛋白酶和淀粉酶，加入 磷酸盐缓冲液研磨至匀浆，离心。现用现配。培养基 菌种储备用琼脂培养基：按 配制。叶酸测定培养基：按 配制。注：以上培养基也可用商品化的合成或成品培养基，用前按说明书配制。标准品叶酸标准品（，：）：纯度，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。标准溶液的配制 叶酸标准储备液（）：准确称取 叶酸标准品，用氢氧化钠乙醇溶液溶解，转移并定容至 棕色容量瓶中。将溶液转移至棕色玻璃容器中，于冰箱避光保存，保存期年。叶酸标准中间液（）：准确吸取 叶酸标准储备液置于 棕色容量瓶中，用氢氧化钠乙醇溶液稀释并定容至刻度，混匀。将溶液转移至棕色玻璃容器中，于冰箱避光保存，保存期年。叶酸标准工作液（）：准确吸取 叶酸标准中间液置于 容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，混匀。现用现配。仪器和设备 天平：感量为 和。恒温培养箱：。高压灭菌锅。涡旋振荡器。离心机：。接种环和接种针。计：精度为。组织粉碎机和研磨仪。紫外可见分光光度计。超净工作台。超声波振荡器。酶标仪。离心管。微孔板（无菌）。滤膜（）。容量瓶。注：所用玻璃器具使用前用盐酸浸泡液或月桂基磺酸钠洗涤剂清洗干净后，干热。犌犅 菌种的制备与保存 菌种鼠李糖乳杆菌犔犪 犮 狋 狅 犫 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊狉 犺 犪犿狀 狅 狊 狌 狊（）或等效菌株。储备菌种的制备将菌种鼠李糖乳杆菌转接至菌种储备用琼脂培养基中，在 恒温培养箱中培养 ，连续传种代代。取出后放入冰箱作为储备菌株保存。实验前将储备菌株接种至菌种储备用琼脂培养基中，在 恒温培养箱中培养 以活化菌株，用于接种液的制备。注：保存周以上的储备菌种，不能立即用作接种液制备，实验前宜连续传种代代以保证细菌活力。接种液的制备实验前一天，取叶酸标准工作液与叶酸测定用培养基混匀，分装至支试管中，于 （）高压灭菌 （或根据培养基标签标识进行灭菌）后即为种子培养液。冷却后用接种环将活化的菌株转种至支种子培养液中，于 恒温培养箱中培养 。取出后将种子培养液混悬，无菌操作下吸取 转种至不加叶酸标准工作液的无菌叶酸测定培养基中，于 再培养，以消耗种子培养液中残存在菌株中的多余叶酸，制成接种液。分析步骤（所有操作均需避光进行）试样制备谷物类、豆类、乳粉等试样需粉碎、研磨、过筛（筛板孔径 ）；肉、蛋、坚果等用均质器制成食糜；果蔬、半固体食品等试样需匀浆混匀，也可采用冷冻干燥粉碎法混匀；液体试样用前振摇混合。上述制备的试样于冰箱可保存周。试样提取 直接提取法测定样品中添加的叶酸含量时，可采用直接提取法。准确称取固体试样 或液体试样，精确至 ，转入锥形瓶中，加入 氢氧化钠乙醇溶液，具塞，超声振荡 至试样完全溶解或分散，转入 容量瓶中，用水定容至刻度。酶解提取法谷薯类、肉蛋乳类、果蔬菌藻类、豆类及坚果类等食品试样中天然存在的叶酸宜采用酶解提取法。准确称取适量试样（含 叶酸），精确至 。一般谷薯类、肉类、乳类、新鲜果蔬、菌藻类试样；蛋类、豆类、坚果类、内脏、干制试样；流质或半流质试样。转入 锥形瓶中，加